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細胞凋亡檢測技術與方法

發(fā)布日期: 2020-03-16
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1. 早期檢測:
1) PS(磷脂酰絲氨酸)在細胞外膜上的檢測:
  PS從細胞膜內(nèi)側轉(zhuǎn)移到外側在細胞受到凋亡誘導后不久發(fā)生, 可能作為免疫系統(tǒng)的識別標志。AnnexinV,一個鈣依賴性的磷脂結合蛋白,能專一性的結合暴露在膜外側的PS,再通過簡單的顯色或發(fā)光系統(tǒng)進行檢測。由于這是一種凋亡早期的活細胞檢測(懸浮細胞和貼壁細胞都適用),可與DNA染料或別的晚期檢測方法相結合來標記凋亡的發(fā)展階段。
  美國著名生物試劑公司CLONTECH和INTERGEN公司分別開發(fā)了多種標記的Annexin V產(chǎn)品,簡便快速,10分鐘就可完成檢測。其中帶熒光標記的Annexin V-EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein)及Annexin V-FITC,靈敏度高,可作為FACS(流式細胞分選)方法篩選凋亡細胞的基礎。由于融合蛋白Annexin V-EGFP,EGFP與PS 的結合比例為1:1,還可進行定量檢測。除此之外,還提供生物素偶聯(lián)的Annexin V,可通過常用的酶聯(lián)顯色反應來檢測。另外,MACS公司將磁珠包被Annexin V,可采用磁分選方法篩選凋亡細胞。

2)細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)改變的檢測:
  這反應了細胞凋亡研究中相對較新的趨勢,研究什么樣的氧化還原環(huán)境引起下游事件的發(fā)生。CLONTECH公司的ApoAlertTM Glutathione Detection Kit通過熒光染料monochlorobimane(MCB)體外檢測凋亡細胞細胞質(zhì)中谷光苷肽的減少來檢測凋亡早期細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的變化。正常狀態(tài)下,谷光苷肽(glutathione:GSH)作為細胞的一種重要的氧化還原緩沖劑。細胞內(nèi)有毒的氧化物通過被GSH還原而定期去除,氧化型的GSH又可被GSH還原酶迅速還原。這一反應在線粒體中尤為重要,許多呼吸作用中副產(chǎn)物的氧化損傷將由此被去除。在Jurcat和一些其它類型的細胞中,細胞膜中有可被凋亡信號啟動的ATP依賴的GSH轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。當細胞內(nèi)GSH的排除非?;钴S時,細胞液就由還原環(huán)境轉(zhuǎn)為氧化環(huán)境,這可能導致了凋亡早期細胞線粒體膜電位的降低,從而使細胞色素C(三羧酸循環(huán)中的重要組分)從線粒體內(nèi)轉(zhuǎn)移到細胞液中,啟動凋亡效應器caspase的級聯(lián)反應。
  由于 GSH與氧化還原作用及線粒體功能密切相關,此項檢測除了對研究細胞凋亡的起始非常有用外,還可用于心臟病、中風等疾病治療的研究。但有些細胞如:HeLa 和3T3細胞凋亡時沒有明顯的GSH水平的變化,不能用此法檢測。

3)細胞色素C的定位檢測
  細胞色素C作為一種信號物質(zhì),在細胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用。正常情況下,它存在于線粒體內(nèi)膜和外膜之間的腔中,凋亡信號刺激使其從線粒體釋放至細胞液,結合Apaf-1 (apoptotic protease activating factor-1)后啟動caspase級聯(lián)反應:細胞色素C/Apaf-1復合物激活caspase-9,后者再激活caspase-3和其它下游caspase。細胞色素C氧化酶亞單位Ⅳ(cytochrome c oxidase subunit Ⅳ:COX4)是定位在線粒體內(nèi)膜上的膜蛋白,凋亡發(fā)生時,它保留在線粒體內(nèi),因而它是線粒體富集部分的一個非常有用的標志。
  ApoAlertTMCell Fractionation Kit不用超離心,可從凋亡和非凋亡細胞中快速有效分離出高度富集的線粒體部分,再進一步通過Western雜交用細胞色素C抗體和COX4抗體標示細胞色素C和COX4的存在位置,從而判斷凋亡的發(fā)生。

4) 線粒體膜電位變化的檢測:
  在凋亡研究的早期,從形態(tài)學觀測上線粒體沒有明顯的變化。隨著凋亡機制研究的深入,發(fā)現(xiàn)線粒體凋亡也是細胞凋亡的重要組成部分,發(fā)生很多生理生化變化。例如,在受到凋亡誘導后線粒體轉(zhuǎn)膜電位會發(fā)生變化,導致膜穿透性的改變。MitoSensorTM,一個陽離子性的染色劑,對此改變非常敏感,呈現(xiàn)出不同的熒光染色。正常細胞中,它在線粒體中形成聚集體,發(fā)出強烈的紅色熒光。凋亡細胞中,因線粒體穿膜電位的改變,它以單體形式存在于細胞液中,發(fā)出綠色熒光。用熒光顯微鏡或流式細胞儀可清楚地分辨這兩種不同的熒光信號。CLONTECH公司的ApoAlert Mitochondrial Membrane Sensor Kit就采用這種原理來檢測線粒體膜電位的變化。但是,這種方法不能區(qū)分細胞凋亡或其他原因?qū)е碌木€粒體膜電位的變化。

2. 晚期檢測:
  細胞凋亡晚期中,核酸內(nèi)切酶(某些Caspase的底物)在核小體之間剪切核DNA,產(chǎn)生大量長度在180-200 bp 的DNA片段。對于這一現(xiàn)象的檢測通常有以下兩種方法:
1) TUNEL(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end-labeling)
  通過DNA末端轉(zhuǎn)移酶將帶標記的 dNTP (多為dUTP)間接 或直接接到DNA片段的3’-OH端,再通過酶聯(lián)顯色或熒光檢測定量分析結果。美國Intergen公司提供多種標記方法,直接熒光標記,介導熒光標記或過氧化物酶聯(lián)顯色,可做細胞懸液、福爾馬林固定或石蠟處理的組織、細胞培養(yǎng)物等多種樣本的檢測。其中,直接標記步驟少,操作簡便。而間接標記有信號放大的作用,檢測靈敏度高。
2) LM-PCR Ladder (連接介導的PCR檢測)
  當?shù)蛲黾毎壤^小以及檢測樣品量很少(如活體組織切片)時,直接瓊脂糖電泳可能觀察不到核DNA的變化。CLONTECH公司的ApoAlert?LM-PCR Ladder Assay Kit通過LM-PCR(ligation-mediated PCR),連上特異性接頭,專一性地擴增核小體的梯度片段,從而靈敏地檢測凋亡時產(chǎn)生的核小體的梯度片段。此外,LM-PCR 檢測是半定量的,因此相同凋亡程度的不同樣品可進行比較。
  上述兩種方法都針對細胞凋亡晚期核DNA斷裂這一特征,但細胞受到其它損傷(如機械損傷,紫外線等)也會產(chǎn)生這一現(xiàn)象,因此它對細胞凋亡的檢測會受到其它原因的干擾。
3) Telemerase Detection (端粒酶檢測)
  這是相對來說推出較早,用得較多的一種方法。端粒酶是由RNA和蛋白組成的核蛋白,它可以自身RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成端粒區(qū)重復序列,使細胞獲得“永生化”。正常體細胞是沒有端粒酶活性的,每分裂一次,染色體的端粒會縮短,這可能作為有絲分裂的一種時鐘,表明細胞年齡、復制衰老或細胞凋亡的信號。研究發(fā)現(xiàn),90%以上的癌細胞或凋亡細胞都具有端粒酶的活性。Intergen公司的TRAP-eze Telemerase Detection Kit在1996年*推出。它提供特定的寡核苷酸底物,分別與底物及端粒重復序列配對的引物。如果待測樣本中含有端粒酶活性,就能在底物上接上不同個數(shù)的6堿基(GGTTAG)端粒重復序列,通過PCR反應,產(chǎn)物電泳檢測就可觀察到相差六個堿基的DNA Ladder現(xiàn)象(參見圖4)。此外,Intergen公司還提供用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測的試劑盒.
   同樣,這種檢測方法也不專對細胞凋亡,檢測結果也不純反應細胞凋亡的發(fā)生。


 

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