我們可能都有過這樣的經(jīng)歷：

辛苦呵護的細胞，怎么也不愿意貼壁；

貼壁了又很容易成塊或者成團掉下來；

原本貼壁的細胞，復(fù)蘇后細胞不貼壁了；

........

遇到這樣的問題你都如何解決？

這次我們就來聊聊

什么是貼壁細胞？

貼壁細胞原理？

細胞貼壁和什么有關(guān)？

為啥你的細胞不愿貼壁呢？

如何促進細胞貼壁？
 

根據(jù)細胞特性分類

1、 懸浮細胞（Suspension Cell）

細胞生長不依賴支持物表面，在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)生長，如淋巴細胞。

2、 貼壁細胞（Adherent Cell）

在動物細胞培養(yǎng)過程中，必須有可以貼附的支持物表面，依靠自身分泌或培養(yǎng)基中的粘附因子才能在該表面生長增殖的細胞。當細胞在該表面生長后，一般形成兩種形態(tài)，即成纖維樣細胞或上皮樣細胞。

▲ 細胞形態(tài)

3、 兼性貼壁細胞

有些細胞并不嚴格地依賴支持物，它們既可以貼附于支持物表面生長，但在一定條件下，也可在培養(yǎng)基中呈懸浮狀態(tài)生長。

貼壁細胞分為：上皮細胞型，成纖維細胞型，游走細胞型和多型細胞型，在顯微鏡下觀察時，貼壁細胞在瓶底伸展并延伸成梭型或不規(guī)則的三角形或扇形或其他形態(tài)，而且晃動培養(yǎng)液時，細胞不動。常見的貼壁細胞有成纖維細胞、骨骼組織（骨及軟骨）、心肌與平滑肌、肝、肺、腎、乳腺皮膚、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、內(nèi)分泌細胞、黑色素細胞以及各種腫瘤細胞等。

體外培養(yǎng)貼壁細胞特點

貼附并伸展，是多數(shù)體外培養(yǎng)細胞的基本生長特點。細胞貼壁的過程使形態(tài)發(fā)生很大變化，細胞形態(tài)改變是細胞內(nèi)骨架（真核細胞中的蛋白纖維網(wǎng)架體系，由微管、微絲及中間纖維組成的體系）本身和細胞外基質(zhì)共同作用的結(jié)果。培養(yǎng)細胞在未貼附于底物之前一般均似球體樣，當與底物貼附后，細胞將逐漸伸展而形成一定的形態(tài)，呈成纖維細胞樣或上皮細胞樣等。細胞附著于底物時并非一種需要能量的過程，一般認為與電荷有關(guān)。據(jù)資料記載，37℃時在2min內(nèi)細胞之間即可形成鍵，該鍵可對0.01%胰蛋白酶起作用且僅發(fā)生于細胞間，細胞與底物之間則無；8min后才有穩(wěn)定的鍵形成。

貼壁細胞（除腫瘤細胞外）在體外培養(yǎng)條件下，完成貼壁后均為單層生長，原因是貼壁細胞有接觸性抑制的特點。一般認為接觸抑制是細胞間的一種識別作用，對于動物細胞的形態(tài)形成與穩(wěn)定具有重要性的作用。由于貼壁細胞的一面是緊貼在培養(yǎng)瓶上的，如果其上方存在細胞與其相粘附，那么下方的細胞很快就會缺乏營養(yǎng)---餓死。

接觸抑制：

1954年，由艾伯克龍比發(fā)現(xiàn)，一些細胞在生長過程中達到相互接觸時停止分裂現(xiàn)象，將其命名為接觸性抑制（Contact Inhibition），后來證實接觸性抑制普遍存在于貼壁細胞之間。

接觸抑制的原理：細胞膜上有糖類和蛋白質(zhì)共同構(gòu)成的糖蛋白，也叫做糖被，它在細胞上起識別作用，當細胞增殖到一定程度，挨在一起時，糖蛋白就會識別這種信號，并且使細胞停止繁殖。

▲ 單層生長

細胞為什么要貼壁

首先并不是所有的細胞在體外培養(yǎng)的情況下都會貼壁，但大部分來自實體組織器官的細胞都會貼壁。

密度大于培養(yǎng)基的細胞（絕大部分細胞）通過重力作用會沉降在底面上，這是種自然屬性，那么細胞要生存必定得改善這個環(huán)境，也是貼壁的主要原因-分泌細胞外基質(zhì)和粘附因子（Extracellular matrix& Cell Adhesion Molecules，ECM&CAM），改善底面的結(jié)構(gòu)，然后很自然就貼附在底面上了。

細胞粘附分子：

是眾多介導(dǎo)細胞間或細胞與細胞外間相互接觸和結(jié)合分子的統(tǒng)稱。

細胞外基質(zhì)：

是由動物細胞合并分泌到胞外、分布在細胞表面或細胞之間的大分子。

二者大多數(shù)均為糖蛋白，因此具有較強的親水性——因此能不能貼壁不僅僅關(guān)乎細胞是否有這種能力，也與有無合適的底物（培養(yǎng)瓶）有關(guān)。

▲ 原理圖（圖源網(wǎng)絡(luò)）

密度小于水的細胞，如脂肪細胞，漂浮在液面上，所以不可能貼在底面上，但是如果將培養(yǎng)液加滿，那么細胞能夠與培養(yǎng)瓶上面的壁接觸同樣可以貼壁。因此可以說，細胞貼壁是適應(yīng)環(huán)境的一種反應(yīng)。

細胞貼壁原理及相關(guān)因素

大多數(shù)的哺乳動物細胞在體內(nèi)和體外均附著于一定的底物而生長，在體外時這些底物可以是其他細胞、膠原、玻璃或塑料等。

貼壁的過程：細胞首先分泌細胞外基質(zhì)，這種細胞外基質(zhì)黏附在支持物的表面（培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)皿的底面）。然后，細胞通過其表面表達的黏附因子與這些細胞外基質(zhì)結(jié)合。

▲ 貼壁過程

一些特殊的促細胞附著物質(zhì)（如層粘連蛋白、纖維連接蛋白、Ⅲ型膠原、血清擴展因子等）可能參加細胞的貼附過程。這些促細胞附著因子均為蛋白質(zhì)，存在于培養(yǎng)液尤其是血清中。在培養(yǎng)過程中，這些帶陽電荷的促貼附因子先吸附于底物上，懸浮的圓形細胞再與已吸附的有促貼附物質(zhì)的底物附著，以后細胞將伸展成其原來的形態(tài)。所以細胞貼壁與否和細胞本身分泌細胞外基質(zhì)的能力以及細胞本身表達的黏附分子的數(shù)量有關(guān)，也與培養(yǎng)皿壁的表面結(jié)構(gòu)有關(guān)。

細胞不貼壁的一些原因

• 1. 胰酶消化時間把控不當：消化不夠細胞本身就是成團的；若胰酶處理太久，容易造成細胞膜蛋白損傷，使細胞貼壁不緊，顯微鏡下觀察立體感不強，嚴重的時候甚至會造成細胞死亡。

• 2. 缺少貼壁因子：血清中含有促貼壁因子，而無血清培養(yǎng)基工藝中由于缺少這種促貼壁因子，細胞的貼壁效果會下降很多。

• 3. 支原體或細菌的污染。

• 4. 培養(yǎng)液配制、儲存不當，如pH值過堿，Gln量太少等原因。

• 5. 復(fù)蘇的細胞本身狀態(tài)不好，已經(jīng)老化，失去貼附性。

• 6. 接種細胞數(shù)目太少，無法分泌足夠的細胞外基質(zhì)。

• 7. 復(fù)蘇時處理速度太慢，復(fù)蘇過程不當。
   

如何促進細胞貼壁

• 1. 適度消化細胞：HepG-2、A549、Hela、SGC-7901幾種癌細胞處理時間可適當放長，一般處理5-6min，C2C12、COS-7、NIH-3T3比較容易脫落，2min足矣，P19Cl6和293細胞貼壁不緊，可在PBS漂洗后，直接換新鮮培養(yǎng)基打散。

• 2. 用塑料瓶培養(yǎng)，如果是玻璃瓶,那么可以用鼠尾膠原包被一下培養(yǎng)瓶，或者用鹽酸對培養(yǎng)瓶進行蝕刻，或者涂Laminin/fibronectin/collagen/BSA，也可以幫助細胞貼附新的培養(yǎng)瓶，細胞不易貼壁，建議加多聚賴氨酸處理。

• 3. 正確配制消化液或培養(yǎng)液。

• 4. 使用合適的細胞外基質(zhì)或貼壁試劑。

• 5. 復(fù)蘇新的細胞，第1周用20%血清幫助細胞復(fù)原。

• 6. 傳代接種一定要鋪的均勻，避免細胞抱團生長。

• 7. 細胞傳代24小時之內(nèi)，不要晃動，以免影響貼壁。

• 8. 體內(nèi)上皮細胞生長在膠原構(gòu)成的基膜上，因此培養(yǎng)在有膠原的底物上有利于生長。人或小鼠表皮細胞培養(yǎng)，可以用γ射線照射后的3T3細胞為飼養(yǎng)層，另外降低pH、Ca²⁺含量和溫度，均有利于上皮細胞生長。

  　　Countess3細胞計數(shù)儀雖然是一款高效的細胞計數(shù)工具，但它本身并不直接涉及細胞貼壁的問題。

  　　細胞不貼壁是在細胞培養(yǎng)過程中常見的問題，可能會影響到實驗結(jié)果的準確性和細胞的正常生長。

  　　以下是關(guān)于細胞不貼壁的一些原因及可能的解決方案：

  　　細胞不貼壁的原因：

  　　培養(yǎng)基條件不適：

  　　pH值不適當：理想的細胞生長pH范圍通常在7.2到7.4之間。過高或過低的pH值都可能影響細胞貼壁。

  　　營養(yǎng)不足：培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分不足或比例不適當，可能導(dǎo)致細胞無法正常貼壁生長。

  　　氧氣或二氧化碳濃度不適：特別是在CO2孵化器中，不恰當?shù)腃O2濃度會影響培養(yǎng)基的pH值，從而影響細胞貼壁。

  　　細胞本身的問題：

  　　細胞狀態(tài)不佳：如在傳代過程中受損或凍存復(fù)蘇過程中受到影響的細胞，可能活力下降，導(dǎo)致無法正常貼壁。

  　　細胞類型特性：有些細胞類型(如懸浮細胞系)自然不易貼壁，需要特殊的培養(yǎng)條件或添加特定的附著因子。

  　　培養(yǎng)容器問題：

  　　容器表面處理不當：細胞可能需要經(jīng)過特殊處理的表面才能有效貼壁，如膠原蛋白或纖維連接蛋白涂層。

  　　容器污染：微生物污染或化學污染也可能影響細胞的貼壁。

  　　操作技術(shù)：

  　　播種密度不當：播種密度太低或太高都可能影響細胞的貼壁和生長。

  　　操作過程中的機械損傷：過度的吸吐或劇烈的震蕩可能會損傷細胞，導(dǎo)致其無法貼壁。

  　　解決方案：

  　　調(diào)整培養(yǎng)基條件：確保pH值、營養(yǎng)成分和氣體濃度處于適宜范圍。

  　　優(yōu)化細胞狀態(tài)：選擇健康、活力好的細胞進行培養(yǎng)，避免使用受損或狀態(tài)不佳的細胞。

  　　選擇合適的培養(yǎng)容器：根據(jù)細胞類型選擇合適的培養(yǎng)容器，并確保其表面處理適合細胞貼壁。

  　　提高操作技術(shù)水平：避免在細胞操作過程中造成不必要的機械損傷，合理控制播種密度。

  　　引入附著因子：對于不易貼壁的細胞類型，可以嘗試添加特定的附著因子來促進細胞貼壁。

  　　使用懸浮培養(yǎng)方法：對于某些自然不易貼壁的細胞類型，可以考慮使用懸浮培養(yǎng)的方法進行培養(yǎng)。

  　　解決細胞不貼壁的問題需要從多個方面綜合考慮，包括培養(yǎng)基條件、細胞狀態(tài)、培養(yǎng)容器和操作技術(shù)等。通過優(yōu)化這些條件和技術(shù)，可以有效地促進細胞的貼壁和生長。