caki-1人腎透明細(xì)胞癌皮膚轉(zhuǎn)移細(xì)胞
細(xì)胞縮寫(xiě): Caki-1細(xì)胞
細(xì)胞名稱: Caki-1(人腎透明細(xì)胞癌皮膚轉(zhuǎn)移細(xì)胞)
詳細(xì)背景: 超微結(jié)構(gòu)中包含許多微絨毛,少許微絲,許多小線粒體,充分發(fā)育的高爾基休和內(nèi)質(zhì)網(wǎng),許多脂滴和多層體,次級(jí)溶酶體,沒(méi)有發(fā)現(xiàn)病毒顆粒。
細(xì)胞來(lái)源: 細(xì)胞主要來(lái)源ATCC、DSMZ、ECACC、RIKEN、promocell、ScienCell、ECACC、JCRB、KCLB、Asterand、ICLC以及少數(shù)國(guó)內(nèi)外著名大學(xué)建系
"購(gòu)買(mǎi)細(xì)胞注意事項(xiàng):
1. 收到細(xì)胞后首先觀察細(xì)胞瓶是否完好,培養(yǎng)液是否有漏液、渾濁等現(xiàn)象,若有上述現(xiàn)象發(fā)生請(qǐng)及時(shí)和我們聯(lián)系。
2. 仔細(xì)閱讀細(xì)胞說(shuō)明書(shū),細(xì)胞了解細(xì)胞相關(guān)信息,如細(xì)胞形態(tài)、所用培養(yǎng)基、血清比例、所需細(xì)胞因子等。
3. 用75%酒精擦拭細(xì)胞瓶表面,顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)。因運(yùn)輸問(wèn)題貼壁細(xì)胞會(huì)有少量從瓶壁脫落,將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)過(guò)夜,隔天再取出觀察。此時(shí)多數(shù)細(xì)胞均會(huì)貼壁,若細(xì)胞仍不能貼壁請(qǐng)用臺(tái)盼藍(lán)染色測(cè)定細(xì)胞活力,如果證實(shí)細(xì)胞活力正常,請(qǐng)將細(xì)胞離心后用新鮮培養(yǎng)基再次貼壁培養(yǎng);如果染色結(jié)果顯示細(xì)胞無(wú)活力,請(qǐng)拍下照片及時(shí)和我們聯(lián)系,信息確認(rèn)后我們?yōu)槟倜赓M(fèi)寄送一次。
4. 建議客戶收到細(xì)胞后前3天各拍幾張細(xì)胞照片,記錄細(xì)胞狀態(tài),便于和公司技術(shù)部溝通交流。" P4
包裝規(guī)格: 復(fù)蘇T25培養(yǎng)瓶(一瓶)或凍存1ml凍存管(兩支)
細(xì)胞規(guī)格: 1*10(5)/ml——1*10(6)/ml
安全水平: 1
細(xì)胞種屬: 人
組織來(lái)源: 腎透明細(xì)胞癌皮膚轉(zhuǎn)移
細(xì)胞形態(tài): 上皮細(xì)胞樣
細(xì)胞特性: 貼壁
細(xì)胞融合度: 95%(Viability by Trypan Blue Exclusion)
細(xì)胞檢測(cè): 細(xì)胞不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌
caki-1人腎透明細(xì)胞癌皮膚轉(zhuǎn)移細(xì)胞
"細(xì)胞培養(yǎng)三不要:
養(yǎng)科研細(xì)胞是生物醫(yī)學(xué)研究的基本功。有三個(gè)小經(jīng)驗(yàn)可以和大家分享一下:
1. 不要燒瓶口。大多數(shù)人都喜歡在酒精燈的火焰上關(guān)瓶子,覺(jué)得這樣可以避免污染。不知道大家是不是有培養(yǎng)基怎么越用越發(fā)紫的困惑?知道為什么嗎?燒瓶口燒的。培養(yǎng)基一般都是用碳酸/碳酸氫跟作緩沖體系。瓶口在火焰上的時(shí)候,熾熱的空氣進(jìn)入瓶?jī)?nèi)。塞緊塞子放入冰箱后,空氣變冷,壓力驟降,培養(yǎng)基中的碳酸就會(huì)轉(zhuǎn)化成二氧化碳,釋放出來(lái)。培養(yǎng)基中的碳酸少了,當(dāng)然會(huì)變堿。如果不燒瓶口的話,你會(huì)發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液變堿的速度會(huì)大大減慢。(當(dāng)然多多少少還是會(huì)有一點(diǎn)越用越堿,因?yàn)槭覝剡€是比冰箱內(nèi)的溫度高)
其實(shí)燒瓶口防止污染純粹是心理安慰。不妨試一下把手指在火上晃幾下,你會(huì)發(fā)現(xiàn)根本就不會(huì)燒疼。如果有細(xì)菌的話,這么晃兩下也燒不死多少。要想燒死全部細(xì)菌,除非把瓶口和塞子燒紅。我在國(guó)內(nèi)從來(lái)就不燒瓶口。來(lái)美國(guó)以后發(fā)現(xiàn)這里更*,超凈臺(tái)內(nèi)根本就不點(diǎn)酒精燈。
2. 不要頻繁看細(xì)胞。對(duì)于初學(xué)者而言,養(yǎng)細(xì)胞就像養(yǎng)孩子一樣,有空就要去看看。細(xì)胞越是養(yǎng)不好,就越是經(jīng)常去看。實(shí)際上看細(xì)胞對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)沒(méi)有任何好處,特別是對(duì)原代細(xì)胞或是免疫磁珠分選后,密度特別低的細(xì)胞。培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)因子是非常有限的。細(xì)胞好不容易自分泌一點(diǎn)兒促生長(zhǎng)的因子在其周?chē)纬捎欣谏L(zhǎng)的局部環(huán)境。你跑去看細(xì)胞,培養(yǎng)瓶這么一晃,把因子都給晃散了。經(jīng)??梢钥吹叫率忠惶斓酵矶荚诳醇?xì)胞,細(xì)胞老是長(zhǎng)不好。老手細(xì)胞一扔好幾天不管,細(xì)胞瘋長(zhǎng)。
3. 不要怕消化。在傳代的時(shí)候,初學(xué)者往往生怕細(xì)胞消化過(guò)度,早早地終止消化。細(xì)胞沒(méi)下來(lái)就使勁吹燈,吹得滿瓶子都是氣泡。在我看來(lái),用力吹打?qū)?xì)胞的損傷比消化更大。我?guī)熜衷谧鲅芷交≡臅r(shí)候,37度消化過(guò)夜,細(xì)胞也沒(méi)事。我一般是等細(xì)胞*變圓后才中止消化。細(xì)胞輕輕一晃就能下來(lái)。還有,動(dòng)作要輕柔,盡量不要產(chǎn)生氣泡。氣泡在破裂時(shí)的機(jī)械應(yīng)力相當(dāng)大,對(duì)細(xì)胞的傷害也是很大的。" 詳見(jiàn)細(xì)胞說(shuō)明書(shū)
傳代方法: 建議1:2-1:3 兩天換液一次
凍存條件: 詳見(jiàn)細(xì)胞說(shuō)明書(shū)
主要文獻(xiàn): 請(qǐng)具體查閱相關(guān)發(fā)表文章
傳代細(xì)胞培養(yǎng)操作步驟
1、 37度水浴加熱所有試劑。
2、 吸取培養(yǎng)培養(yǎng)皿內(nèi)舊培養(yǎng)液,放置一個(gè)干凈離心管內(nèi)。(為稍后終止消化作準(zhǔn)備。)
3、 用PBS清洗培養(yǎng)皿,棄去。
4、 向瓶?jī)?nèi)加入消化液(胰蛋白酶液)。以能覆蓋培養(yǎng)瓶底為宜。(一般一個(gè)大皿1ml)
5、 2-5分鐘后,輕輕震蕩培養(yǎng)皿。使細(xì)胞從瓶壁脫離形成細(xì)胞懸液。顯微鏡下觀察若細(xì)胞由貼壁變?yōu)閼腋【图尤胙澹丛囵B(yǎng)液)終止消化。
6、 收集細(xì)胞懸液,880轉(zhuǎn)/分、5分鐘離心,棄去上清液。
7、 加培養(yǎng)液至1ml,混勻后取10ul計(jì)數(shù)細(xì)胞。
8、 根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求取適量細(xì)胞留種或接種于新的培養(yǎng)皿或96孔板、24孔板中,再加入相應(yīng)體積的培養(yǎng)液。(90mm大皿是9ml,中皿好像是4mm,6孔板和小皿是2ml,96孔板是100ul)。
9、 接種好的培養(yǎng)皿順時(shí)針和逆時(shí)針各轉(zhuǎn)三圈,使細(xì)胞排列均勻。
10、 放入暖箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
細(xì)胞計(jì)數(shù)步驟:
1、將計(jì)數(shù)板及蓋片擦拭干凈,并將蓋片蓋在計(jì)數(shù)板上.
2、將細(xì)胞懸液吸出少許,用臺(tái)盼蘭溶液對(duì)被稀釋后滴加在蓋片邊緣,使懸液充滿蓋片和計(jì)數(shù)板之間。(臺(tái)盼蘭用于標(biāo)記死亡細(xì)胞。)
3、鏡下觀察,計(jì)算計(jì)數(shù)板八大格細(xì)胞總數(shù),壓線細(xì)胞只計(jì)左側(cè)和上方的。然后按下式計(jì)算:
細(xì)胞數(shù)/ml=8大格細(xì)胞總數(shù)/ 8×2×10000
細(xì)胞凍存與復(fù)蘇:
凍存和復(fù)蘇的原則:慢凍快融
當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下,可以產(chǎn)生以下變化:細(xì)胞器脫水,細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高,并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。
如果緩慢冷凍,可使細(xì)胞逐步脫水,細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶;相反,結(jié)晶很大,大結(jié)晶會(huì)造成細(xì)胞膜、細(xì)胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過(guò)程應(yīng)快融,目的是防止小冰晶形成大冰晶,即冰晶的重結(jié)晶。
1.凍存細(xì)胞
(1)選對(duì)數(shù)增生期細(xì)胞,在凍存前1d換液。
(2)按常規(guī)方法把培養(yǎng)細(xì)胞制備成懸液,計(jì)數(shù),使細(xì)胞密度達(dá)5×106/m1左右密度,離心,去上清。
(3)加入配制好的凍存液(培養(yǎng)液6.8ml,小牛血清2ml,DMSO 1ml,5.6%NaHCO3 0.1ml),按與去上清相同的量一滴一滴加入離心管中,然后用吸管輕輕吹打令細(xì)胞成再懸液。凍存細(xì)胞時(shí)培養(yǎng)液中加入保護(hù)劑10%二甲基亞砜(DMSO) 或甘油,它是一種滲透性保護(hù)劑,可迅速透入細(xì)胞,提高胞膜對(duì)水的通透性,降低冰點(diǎn),延緩凍結(jié)過(guò)程,能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外,在胞外形成冰晶,減少胞內(nèi)冰晶,從而減少冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷
(4)分裝于無(wú)菌凍存管中,每管加1.5m1懸液。
(5)旋好凍存管并仔細(xì)檢查,一定要蓋緊,作好標(biāo)記。
(6)凍存:在特殊的儀器或簡(jiǎn)易的液氮容器中,按-1℃/min的速度,在30~40 min時(shí)間內(nèi),下降到液氮表面,再停30 min后,直接投入液氮中。要適當(dāng)掌握下降冷凍速度,過(guò)快能影響細(xì)胞內(nèi)水分透出,太慢則促進(jìn)冰晶形成。
標(biāo)準(zhǔn)程序:
當(dāng)溫度在-25℃以上時(shí), 1~2℃/min
當(dāng)溫度達(dá)-25℃以下時(shí), 5~10℃/min
當(dāng)溫度達(dá)-100℃時(shí),可迅速放入液氮中
簡(jiǎn)易程序:
將冷凍管(管口要朝上)放入紗布袋內(nèi),紗布袋系以線繩,通過(guò)線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口,按每分鐘溫度下降1~2℃的速度,在40分鐘內(nèi)降至液氮表面,停30分鐘后,直接投人液氮中。
操作時(shí)應(yīng)戴防護(hù)眼鏡和手套,以免液氮凍傷。
2. 復(fù)蘇細(xì)胞
(1)從罐中取出凍存管。
(2)迅速放入37℃水浴,不時(shí)搖動(dòng),使其急速融化,30~60s內(nèi)完成。
(3)凍存管用70%酒精擦拭消毒后,打開(kāi)蓋子,用吸管將細(xì)胞懸液注入離心管中,再滴加10 m1培養(yǎng)液。
(4)低速離心(880r/min) 5 min,去上清后再用培養(yǎng)液洗一次。
(5)用培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后,裝入培養(yǎng)瓶37℃培養(yǎng),次日更換一次培養(yǎng)液后,繼續(xù)培養(yǎng)。以后仍按常規(guī)進(jìn)行培養(yǎng)。
凍存細(xì)胞數(shù)量要充分,密度應(yīng)達(dá)到107/m1,在融后稀釋20倍后,仍能保持5×105/m1數(shù)量。