KP-3導管癌細胞

注意事項如下:

1 收到細胞后首先觀察T-25瓶是否有損壞、漏液、渾濁等現(xiàn)象，若有上述現(xiàn)象發(fā)生請及時和我們聯(lián)系。

2 對于貼壁細胞，若細胞漂浮:培養(yǎng)瓶不開封，用75%酒精擦拭后平躺置于培養(yǎng)箱內。次日觀察，如細胞大部分又貼回瓶底，表明細胞活力正常，剩余漂浮的細胞可以去掉;如細胞還不貼壁，將細胞離心收集移到新的培養(yǎng)瓶中，原培養(yǎng)瓶加部分培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，中間注意觀察，我們的技術人員會一直跟蹤指導，直到問題解決。

3 建議客戶收到細胞后前3天各拍幾張細胞照片，記錄細胞狀態(tài)，便于和本公司技術部溝通交流。

素爾細胞庫提供遺傳變異細胞系、正常組織來源細胞系、腫瘤細胞系、工程細胞系、干細胞系，涉及人類，大鼠、小鼠、鳥類、倉鼠、魚類、貓類、狗、牛、貂、豬、恒河猴、長鼻袋鼠等。

第三節(jié) 天然細胞培養(yǎng)基

天然培養(yǎng)基是指來自動物體液或利用組織分離提取的一類培養(yǎng)基，如血漿、血清、淋巴液、雞胚浸出液等。組織培養(yǎng)技術建立早期，體外培養(yǎng)細胞都是利用天然培養(yǎng)基。但是由于天然培養(yǎng)基制作過程復雜、批間差異大，因此逐漸為合成培養(yǎng)基所替代。目前廣泛使用的天然培養(yǎng)基是血清，另外各種組織提取液、促進細胞貼壁的膠原類物質在培養(yǎng)某些特殊細胞也是必不可少。

一、血清(serum)細胞培養(yǎng)的發(fā)展，培養(yǎng)基的質量又是關鍵，而培養(yǎng)基的主要成份中動物血清對細胞的生長繁殖發(fā)揮著重要甚至是難以替代的作用。在動物血清的應用中牛血清又是較為廣泛的，所以血清是醫(yī)藥生物技術產品中重要的原材料之一。保證血清質量也是促進生物制品質量提高的重要環(huán)節(jié)。

1、血清種類:目前用于組織培養(yǎng)的血清主要是牛血清，培養(yǎng)某些特殊細胞也用人血清、馬血清等。選擇用牛血清培養(yǎng)細胞的原因:來源充足、制備技術成熟、經過長時間的應用考驗人們對其有比較深入的理解。牛血清對絕大多數(shù)哺乳動物細胞都是適合的，但并不排除在培養(yǎng)某種細胞時使用其他動物血清更合適。

牛血清是細胞培養(yǎng)中用量最大的天然培養(yǎng)基，含有豐富的細胞生長必須的營養(yǎng)成份，具有極為重要的功能。牛血清分為小牛血清、新牛血清、胎牛血清。胎牛血清應取自剖腹產的胎牛;新牛血清取自出生24小時之內的新生牛;小牛血清取自出生10-30天的小牛。顯然，胎牛血清是品質最高的，因為胎牛還未接觸外界，血清中所含的抗體、補體等對細胞有害的成分最少。

2、血清的主要成分:血清是由血漿去除纖維蛋白而形成的一種很復雜的混合物，其組成成份雖大部分已知，但還有一部分尚不清楚，且血清組成及含量常隨供血動物的性別、年齡、生理條件和營養(yǎng)條件不同而異。血清中含有各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長因子、激素、無機物等，這些物質對促進細胞生長或抑制生長活性是達到生理平衡的。對血清的成分和作用的研究雖有很大進展，但仍存在一些問題。主要是:

*:血清的成份可能有幾百種之多，目前對其準確的成份、含量及其作用機制仍不清楚，尤其是對其中一些多肽類生長因子、激素和脂類等尚未充分認識，這給研究工作帶來許多困難;

第二:血清都是批量生產，各批量之間差異很大，而且血清保存期至多一年，因此，要保證每批血清的相似性極為困難，從而使實驗的標準化和連續(xù)性受到限制;

第三:不能排除血清中含有易變物質，這被認為是“瓶中惡化”的原因之一。

3、血清主要作用:

提供基本營養(yǎng)物質:氨基酸、維生素、無機物、脂類物質、核酸衍生物等，是細胞生長必須的物質。

提供激素和各種生長因子:胰島素、腎上腺皮質激素、類固醇激素(雌二醇、睪酮、孕酮)等。生長因子如成纖維細胞生長因子、表皮生長因子、血小板生長因子等。

提供結合蛋白:結合蛋白作用是攜帶重要地低分子量物質，如白蛋白攜帶維生素、脂肪、以及激素等，轉鐵蛋白攜帶鐵。結合蛋白在細胞代謝過程中起重要作用。

提供促接觸和伸展因子使細胞貼壁免受機械損傷。

對培養(yǎng)中的細胞起到某些保護作用:有一些細胞，如內皮細胞、骨髓樣細胞可以釋放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用。這種作用是偶然發(fā)現(xiàn)的，現(xiàn)在則有目的的使用血清來終止胰蛋白酶的消化作用。因為胰蛋白酶已經被廣泛用于貼壁細胞的消化傳代。血清蛋白形成了血清的粘度，可以保護細胞免受機械損傷，特別是在懸浮培養(yǎng)攪拌時，粘度起到重要作用。血清還含有一些微量元素和離子，他們在代謝解毒中起重要作用，如SeO₃,硒等。

4、細胞培養(yǎng)中使用血清的缺點

血清成分復雜，雖含許多對細胞有利成分，也含有對細胞有害的成分，使血清有幾個明顯的缺點:

對大多數(shù)細胞，在體內狀態(tài)，血清不是它們接觸的生理學液體，只是在損傷愈合以及血液凝固過程中才接觸血清，因此使用血清有可能改變某種細胞在體內的正常狀態(tài)，血清可能促進某些細胞的生長(成纖維細胞)同時抑制另一類細胞生長(表皮細胞)。

血清含一些對細胞產生毒性的物質，如多胺氧化酶，能與來自高度繁殖細胞的多胺反應(如精胺、亞精胺)形成有細胞毒性作用的聚精胺。補體、抗體、細菌毒素等都會影響細胞生長，甚至造成細胞死亡。

動物個體不同，血清產地、批號不同，每批質量差異甚大，其成分不能保持*。

取材中可能帶入支原體、病毒，對細胞產生潛在影響，可能導致實驗失敗或實驗結果不可靠性。

血清的使用使得實驗和生產的標準化困難，其中的蛋白質使得某些轉基因蛋白生物藥品生產中分離純化工作很難完成。

大規(guī)模生產中，血清來源越來越困難，價格昂貴，是構成動物細胞培養(yǎng)對生產成本的主要部分之一。

5、血清的質量標準:血清質量高低取決于兩方面因素:一是取材對象，二是取材過程。用于取材的動物應健康無病并且在的出生天數(shù)之內，取材過程應嚴格按照操作規(guī)程執(zhí)行，制備出的血清要經過嚴格的質量鑒定。WHO公布的《用動物細胞體外培養(yǎng)生產生物制品規(guī)程》中的要求:

牛血清必須來自有文件證明無牛海綿狀腦病的牛群或國家。并應具備適當?shù)谋O(jiān)測系統(tǒng)。

有些國家還要求牛血清來自未用過反芻動物蛋白飼料的牛群。

證明所用牛血清中不含對所生產疫苗病毒的抑制物。

血清要通過濾膜過濾除菌，保證無菌。

無細菌、霉菌、支原體和病毒的污染，有些國家要求無細菌噬菌體污染。

對細胞有良好的支持繁殖作用。

我國在對牛血清的質量2000年版《中國生物制品主要原輔料質控標準》中提出比較嚴格的標準要求。包括蛋白質含量，細菌、真菌、支原體、牛病毒、大腸桿菌噬菌體、細菌內毒素，支持細胞增殖檢查。

血清質量的鑒定一般包括以下幾個方面:

理化性質:如滲透壓、pH值、蛋白電泳圖譜、蛋白含量、激素水平、內毒素等。蛋白含量包括血清總蛋白含量(不低于35-45g/L)、球蛋白含量(應小于20g/L)、血紅蛋白含量等。其中球蛋白含量是一項非常重要的指標，血清中球蛋白主要是抗體，球蛋白含量越低血清質量越高。血紅蛋白也是越低越好。

微生物檢測:包括細菌、真菌、支原體、病毒等。特別是對支原體、病毒的檢測，支原體是一種很小的微生物，可通過孔徑22u的濾膜。支原體、病毒污染在光學顯微鏡下難于察覺，細胞也能生長繁殖，但會影響實驗結果。檢測支原體的方法很多，如培養(yǎng)法、PCR法、熒光染色法、電鏡觀察法等。

KP-3導管癌細胞

促生長效果:這是血清重要的特性之一，應當以培養(yǎng)的細胞來檢測。有兩種方法:克隆形成率、貼瓶率測定法和連續(xù)傳代培養(yǎng)法。

(1)克隆形成率測定:一般以懸浮生長的細胞為培養(yǎng)對象，按有限稀釋法做克隆化培養(yǎng)，將不同批號的血清配制成不同濃度的培養(yǎng)基，細胞也稀釋成不同濃度，接種到96孔板，每孔200ul，培養(yǎng)一定時間，統(tǒng)計有克隆生長的孔，計算出百分比，再與對照的標準血清相比較，就可看出不同批號血清間的區(qū)別。比較低的濃度，更能觀察出血清質量間的細微差別。

(2)貼瓶率測定:是以貼壁細胞為培養(yǎng)對象，將細胞稀釋至低密度，接種至平皿，每皿200或100個細胞，以不同濃度的血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)一定時間后棄培養(yǎng)基，染色后統(tǒng)計集落數(shù)，計算出集落數(shù)占接種細胞數(shù)的百分比，同樣再與標準血清比較，判斷血清質量高低。

(3)連續(xù)傳代培養(yǎng)法:是將細胞培養(yǎng)于3個一定體積的培養(yǎng)瓶中，待測血清配制為5%濃度，一般于第七天收集細胞，計數(shù)，取平均值，中間可以更換一次培養(yǎng)基。連續(xù)測試三個周期以上，觀察細胞生長狀況，并將每次的計數(shù)結果與標準血清的測試結果比較。

對于使用者，判斷血清質量先從外觀入手。好的血清應該是透明清亮，土黃色或棕黃色，無沉淀或極少沉淀，比較粘稠。如發(fā)現(xiàn)血清渾濁、不透明、含許多沉淀物，說明血清污染或血清中的蛋白質變性;若血清呈棕紅色，說明血清中的血紅蛋白含量太高，取材時有溶血現(xiàn)象;如果搖晃時感覺液體稀薄，說明血清中摻入的生理鹽水太多。如果要進一步了解血清的質量，則應連續(xù)培養(yǎng)某些細胞，觀察細胞生長狀況。

6、血清的使用與儲存:正確的使用及保存血清，才能使血清發(fā)揮應有的作用。

使用前處理:大部分血清在使用前必須滅活處理，即56℃30分鐘。滅活的目的是去除血清中的補體成分，避免補體對細胞產生毒性作用。血清經過滅活也會損失一些對細胞有利的成分，如生長因子，因此也有人提出血清不經滅活直接用于培養(yǎng)，這樣做的前提是確認血清中不含補體成分。對于一些品質高的胎牛血清和新牛血清可以考慮不經滅活直接用于細胞培養(yǎng)。

儲存條件:血清一般儲存于-20℃，同時應避免反復凍融。購買大包裝的血清后，首先要滅活處理，然后分裝成小包裝，儲存于-20℃，使用前融化。融化時現(xiàn)置于4℃。融化后的血清在4℃不宜長時間存放，應盡快使用。

使用濃度:自從有了合成培養(yǎng)基，血清就是作為一種添加成分與合成培養(yǎng)基混合使用，使用濃度一般為5-20%，較常用是10%。過多血清容易使培養(yǎng)中的細胞發(fā)生變化，特別是一些二倍體的無限細胞系，迅速生長之后容易發(fā)生惡性轉化。 采購血清時,先從供應商處索取樣品進行試驗，選定一批后就要保留足夠使用6個月至1年的量，直至用另一批經過預先試驗的樣品代替。

二、胚胎浸出液

胚胎浸出液(embryonic extract)是早期動物細胞培養(yǎng)中應用的天然培養(yǎng)基，現(xiàn)已很少使用。

三、水解乳蛋白 水解乳蛋白(lactalbumin hydrolysate)為乳白蛋白經蛋白酶和肽酶水解的產物，含有豐富的氨基酸，是常用的天然培養(yǎng)基，可用于許多細胞和原代細胞的培養(yǎng)。